柔嫩艾美耳球虫3-1E基因的原核表达

 

摘要:鸡球虫病是造成当今世界养鸡业各种损失的主要原因之一。其危害很大,轻则造成鸡的生长发育受阻、生产性能下降。重则造成鸡的大批死亡,尤其是鸡雏阶段,15 -50日龄的鸡雏发病率高,死亡率高达80%。随着集约化养殖业的发展和鸡对化学疗法抵抗力的增强以及虫株耐药性和药物的污染等,致使本病的危害日趋严重,因此,做好鸡球虫流行病学调查对于该病的防治具有重要的意义。

  

关键词:艾美耳球虫:流行病学:巢式PCR3-1E基因:表达

 

一、鸡球虫概述

    鸡球虫病(Coccidiosis)是由顶复器门(Apicomplexa孢子虫纲(Sporozoasida)球虫亚纲(Coccidiasina)真球虫目(Eueoccidiasina)艾美耳科(Eimeriidae)艾美耳属C Eimeria球虫引起的鸡寄生原虫病。目前,大多数学者认为是的由艾美耳属C Eimeria9种球虫引起的寄生原虫病,病原包括柔嫩艾美耳球虫(E. tehella} ,毒害艾美耳球虫(E.necatrix}、堆型艾美耳球虫(E. acervuleha}、巨型艾美耳球虫(E. maxima )、布氏艾美耳球虫(E. bruhetti ) ,早熟艾美耳球虫(E.praecox)、和缓艾美耳球虫(E.mitis}、变位艾美耳球虫(E.mivati和哈氏艾美耳球虫(E.hagahi),其中变位艾美耳球虫和哈氏艾美耳球虫尚未被普遍承认。其中致病力最强的为柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫,有一定致病力的为堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫,而布氏艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、变位艾美耳球虫和哈氏艾美耳球虫的致病力最弱。

1.1鸡球虫的流行病学

1.2.1鸡球虫病临床症状

    鸡球虫病的发生,往往是鸡在短期内受到球虫的严重感染所引起。根据球虫虫种所导致的症状程度及病程长短,可分为急性型和慢性型两种,急性球虫病又分为急性言肠球虫病和急性小肠球虫病。鸡球虫病症状的轻重一般取决于一次性感染卵囊数量和虫种。单独感染一种球虫且摄取的卵囊数量在103以下时,儿乎不表现症状:当几种卵囊混合感染时症状加剧,鸡雏的死亡率升高。急性型球虫病病程较短,数日至二、三周死亡。病鸡鸡冠与勃膜色苍白或发青,泄殖孔周围羽毛被液状排泄物污染,常带血液。由于球虫种类不同,对肠管侵害的部位和程度也不同。慢性型一般无明显的临床症状,主要表现病鸡羽毛逆立、体温下降,剖检无显著病变。

在球虫的白然感染病例中,一种球虫单独感染的病例很少,一般多为儿种球虫的混合感染,但并不是儿种球虫同等程度的感染。在发病期鸡雏粪便中的卵囊数量,一个时期多以一种球虫占有绝对优势。而当这一球虫发育完成时,则是另外一种球虫的卵囊占有优势。另外,球虫种类不同其致病性有很大差异:}1}柔嫩艾美耳球虫寄生于言肠及其附近肠道组织,言肠的浆膜面表现为有淤血点,严重时病灶连成一片,言肠壁由于水肿和细胞浸润和后期出现的疤痕组织高度增厚,肠腔内充满凝血块和言肠勃膜碎片,后期言肠肠芯变硬。(2)毒害艾美耳球虫病在肠道中部成段肿胀,长度缩短到约为正常的一半,而其直径为正常的两倍以上。从浆膜面观察,就膜的排红色非常显著,肠壁充血,可见到就膜出血斑点和灰白色针尖大到针帽大的坏死灶。坏死灶可延伸到黏膜深处。坏死灶周围黏膜呈红色,有充血及出血,出血从坏死灶中央开始逐渐向外扩展。在发病早期弥散性炎症反应和毛细血管出血占优势,肠内容物呈暗红色或猩红色而且含血凝块或纤维蛋白,呈“盐和黑胡椒”状外观。(3)堆型艾美耳球虫通常寄生在十二指肠和小肠前段上皮细胞,可引起肠壁增厚,产生白色斑点或斑状融合,从十二指肠浆膜面看到结节状或沙粒样的白色梯状病变是该病的特征性病变。(4)巨型艾美耳球虫病变主要表现为小肠中上段黏膜出血、增厚,严重感染时,肠道内充满液体,含有黄色或橙色的粘液和血液,常描述为臌气。(5)和缓艾美耳球虫寄生在小肠下段,从卵黄蒂到盲肠颈。该病病变不明显,可通过显微镜检查,其卵囊形态为亚球形。(6)布氏艾美耳球虫也寄生在小肠下段,感染没有明显可见的病变。其它几种球虫特征性病变不明显。

二、柔嫩艾美耳球虫HN31E基因的原核表达与鉴定

2.1材料与方法

2.1.1虫株

    E. tenella HN 株,由海南省农业科学院畜牧兽医所实验室分离、鉴定并保存。

2.1.2菌种和载体

    p GEX4T1载体、pMD18T载体购自Ta Ka-a ( 大连) 有限公司: DH5α 菌株、大肠杆菌 BL21JM109菌株均由海南省农业科学院畜牧兽医所实验室保存。

2.1.3酶和主要试剂

    T4DNA连接酶、RNA酶抑制剂购自Promega公司: 限 制 性 内 切 酶Xho IEco IHind III均 为Ta Kaa( 大连 ) 有限公司产品: 总RNA提取试剂盒、Quant c DNA第一链合成试剂盒、PCR产物纯化回收试剂盒、重组质粒抽提试剂盒,均购自天根生物工程有限公司: 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记兔抗山羊Ig G购自武汉博士德生物工程有限公司: 兔抗鸡E. tenella HN株阳性血清由本实验室制备并保存。

2.1.4 E. tenella孢子化卵囊总RNA的提取

    取适量纯孢子化卵囊经DEPC处理水离心洗涤后,用液氮研磨破碎卵囊,按总RNA提取试剂盒说明书操作,提取总RNA

2.2结果

2.2.1  TPCR扩增

    如图1所示,琼脂糖凝胶电泳表明扩增出约513bp大小的特异性片段,与预期结果相符。

 

2.2.2重组质粒pMD1T3-1E的鉴定

    构建的克隆载体pMD18T31EEcoRIHindIII双酶切后得到513bp的特异性片段,与预期结果相一致,说明扩增的DNA片段成功插入pMD18T载体。

2.2.3测序结果与同源性分析

    通过NCBI的阅读框(OFFinder分析,E.tenellaHN31E基因包含1OF,长度为513bp,共编码170个氨基酸。利用DNAStar软件将E.tenellaHN株的31E基因序列与已发表的柔嫩艾美耳球虫E.tGS31EAY660552.1)、E.tYL31EEF069437.1)、E.tsporozoiteantigen31EEF426471.1),堆形艾美耳球虫(E.acervulinaE.a31EUSAF113613.1)和E.aQH31EAY660553.1)基因序列进行对比分析发现,核苷酸的同源性分别为99.8%99.6%99.8%99.8%99.2%,核苷酸的差异主要表现在5个位点上,分别是284286292441447:氨基酸的同源性分别为99.4%99.8%100%100%98.2%,氨基酸的差异主要表现在4个位点上,分别是959698149:其中位点441处核苷酸发生的变化未引起相应的氨基酸发生改变(表1)。

 

2.3讨论

    本研究成功克隆了鸡柔嫩艾美耳球虫HNE.t31E,并将E.t31E与原核表达载体pGEX4T1连接构建了pGEX31E重组表达质粒,在其宿主菌中获得了高效表达,表达率可达菌体成分的30%以上,比徐慧等报道的表达率低,可能是不同的表达载体造成的。表达的重组抗原为融合蛋白,经纯化后可与兔抗鸡E.tenellaHN株阳性血清发生反应,说明该蛋白具有免疫反应性,为进一步研究该重组抗原的免疫保护功能奠定了基础。

三、 3-1E基因的克隆和表达

    柔嫩艾美耳球虫可引起严重的盲肠球虫病,导致盲肠肿大、便血,在实际生产中引起的经济损失最大,可直接造成鸡只大量死亡。3-1E基因是球虫子孢子的表面抗原,重组3-1E蛋白可以促进免疫鸡对球虫感染的免疫保并诱导IFN-γ的生成(周建民,2004),是一个较为理想的疫苗候选抗原基因。而且3-1E基因在柔嫩艾美耳球虫,堆型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫之间有较高的同源性,这使得该蛋白可能会成为了一个很好的疫苗抗原用于鸡球虫病的预防。

四、结论

     本实验选取柔嫩艾美耳球虫,进行总RNA提取,成功克隆柔嫩艾美耳球虫的保守基因—3-1E基因,核苷酸片段长为513bp;构建重组表达质粒p ET-32a-3-1E,并得到了高效表达,蛋白分子量为36.47kuWesten-blot分析表明表达的蛋白可被感染柔嫩艾美耳球虫鸡的阳性血清特异地识别。

 

参考文献

[1] 杨成君,王军. cDNA文库的构建策略及其应用[J]. 生物技术通报. 200701

[2] 刘全,刘文森,王祥生,陈丽凤. 伊氏锥虫cDNA表达文库的构建[J]. 中国病原生物学杂志. 200605

[3] 朱绍春,赵志荣,雷黎,张林杰,沈际佳. 日本血吸虫童虫文库免疫筛选及其高丰度表达膜蛋白初步鉴定[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 200602

鹏程论文网是一家专业致力于服务各类毕业论文、职称论文发表的论文高端辅导机构,专业论文代写,代写硕士论文,是您代写论文代写毕业论文的明智之选。 

  • 大成 :
  • 99658261
  • 大秦 :
  • 340504978

移动办公:18310981858

鹏程论文网提供MBA/MPA、经济管理、工商管理、教育管理、法律硕士、医学硕士、软件工程、在职硕士以及电子信息技术、计算机等各专业的硕士论文代写服务,还包括开题报告的撰写。 无需定金,信誉保证,当面交易,安全可靠 .

杂志库 更多>>